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慢病毒感染后熒光表達較弱的原因
點擊次數:609 更新時間:2023-02-06

熒光蛋白的亮度與啟動子、表達方式和連接原件等有關,不同啟動子誘導熒光蛋白表達的強弱不同,如UBC相對于EF1α、CAG、CMV等強啟動子表達較弱。

融合或非融合表達與熒光強度也有很大關系,融合表達時熒光蛋白可能出現錯誤折疊等現象,導致檢測不到熒光信號或熒光較弱。非融合表達時一般選擇連接肽作為連接原件,如2A肽或IRES將ORF分隔開;選擇IRES,下游ORF的表達明顯弱于上游,2A肽可以避免上下游ORF表達強弱不一致的問題,因此更為常用,如P2A和T2A不過2A肽切割后容易有殘留氨基酸。

帶熒光的慢病毒感染細胞后,熒光的強度取決于病毒進入到細胞的顆粒數、細胞狀態、細胞類型、觀察時間等因素,熒光表達的強度與目的細胞感染病毒的顆粒數正相關,一般感染細胞后72h觀察熒光強度最佳,而增殖較慢的細胞可以適當延長時間。

也可能會遇到過表達的慢病毒比對照的熒光要暗的情況,這主要是因為基因的插入,會影響位于下游的熒光蛋白表達,對照或干擾的病毒由于沒有插入或插入序列非常短熒光不受影響,而插入基因后,尤其是較長片段和高GC片段,則會降低熒光強度。

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