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遠慕技術:測定蛋白質含量的6種方法!
點擊次數:875 更新時間:2021-07-22
  一、微量凱氏(kjeldahl)定氮法
 
  樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產生氨(消化),氨又與硫酸作用,變成硫酸氨。經強堿堿化使之分解放出氨,借蒸汽將氨蒸至酸液中,根據此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例,其反應式如下:
 
  NH2 CH2 COOH+3H2 SO4 ――2CO2 +3SO2 +4H2O+NH3 (1)
 
  2NH3 +H2 SO4 ――(NH4 )2 SO4 (2)
 
  (NH4 )2 SO4 +2NaOH――2H2 O+Na2 SO4 +2NH3 (3)
 
  反應(1)、(2)在凱氏瓶內完成,反應(3)在凱氏蒸餾裝置中進行。
 
  為了加速消化,可以加入CuSO4作催化劑,K2SO4以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液,滴定則用強酸。實驗和計算方法這里從略。
 
  計算所得結果為樣品總氮量,如欲求得樣品中蛋白含量,應將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進一步求得樣品中蛋白質的含量,即用樣品中蛋白氮乘以6.25即得。
 
  二、雙縮脲法(biuret法)
 
  (一)實驗原理
 
  雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩個分子脲經180℃左右加熱,放出一個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物,稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵,或能過一個中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應。
 
  紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比,而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關,故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為1-10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有:硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。
 
  此法的優點是較快速,不同的蛋白質產生顏色的深淺相近,以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速,但并不需要十分精確的蛋白質測定。
 
  (二)試劑與器材
 
  1.試劑:
 
  (1)標準蛋白質溶液:用標準的結晶牛血清清蛋白(bsa)或標準酪蛋白,配制成10mg/ml的標準蛋白溶液,可用bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來校正其純度。如有需要,標準蛋白質還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量,計算出其純度,再根據其純度,稱量配制成標準蛋白質溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05NaOH配制。
 
  (2)雙縮脲試劑:稱以1.50克硫酸銅(CuSO4•5H2O)和6.0克酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6•4H2O),用500毫升水溶解,在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水稀釋到1升,貯存于塑料瓶中(或內壁涂以石蠟的瓶中)。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現,則需要重新配制。
 
  2.器材:
 
  可見光分光光度計、大試管15支、旋渦混合器等。
 
  (三)操作方法
 
  1.標準曲線的測定:取12支試管分兩組,分別加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的標準蛋白質溶液,用水補足到1毫升,然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后,在室溫(20~25℃)下放置30分鐘,于540nm處進行比色測定。用未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值,以蛋白質的含量為橫座標,光吸收值為縱座標繪制標準曲線。
 
  2、樣品的測定:取2~3個試管,用上述同樣的方法,測定未知樣品的蛋白質濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。
 
  三、folin―酚試劑法(lowry法)
 
  (一)實驗原理
 
  這種蛋白質測定法是最靈min的方法之一。過去此法是應用*泛的一種方法,由于其試劑乙的配制較為困難(現在已可以訂購),近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即folin―酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。
 
  這兩種顯色反應產生深蘭色的原因是:在堿性條件下,蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。folin―酚試劑中的磷鉬酸鹽―磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,蘭色深度與蛋白的量成正比。
 
  folin―酚試劑法最早由lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以后在生物化學領域得到廣泛的應用。這個測定法的優點是靈敏度高,比雙縮脲法靈敏得多,缺點是費時間較長,要精確控制操作時間,標準曲線也不是嚴格的直線形式,且專一性較差,干擾物質較多。
 
  對雙縮脲反應發生干擾的離子,同樣容易干擾lowry反應。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素(0.5%),硫酸納(1%),硝酸納(1%),三lv乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙mi(5%),丙酮(0.5%)等溶液對顯色無影響,但這些物質濃度高時,必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液,只須加濃碳酸鈉―氫氧化鈉溶液,即可顯色測定。若樣品酸度較高,顯色后會色淺,則必須提高碳酸鈉―氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。
 
  進行測定時,加folin―酚試劑時要特別小心,因為該試劑僅在酸性ph條件下穩定,但上述還原反應只在ph=10的情況下發生,故當folin一酚試劑加到堿性的銅―蛋白質溶液中時,必須立即混勻,以便在磷鉬酸―磷鎢酸試劑被破壞之前,還原反應即能發生。
 
  此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。
 
  此法可檢測的蕞低蛋白質量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。
 
  (二)試劑與器材
 
  1.試劑
 
  (1)試劑甲:
 
  (a)10克Na2CO3,2克NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6•4H2O)。溶解于500毫升蒸餾水中。
 
  (b)0.5克硫酸銅(CuSO4•5H2O)溶解于100毫升蒸餾水中,每次使用前,將50份(a)與1份(b)混合,即為試劑甲。
 
  (2)試劑乙:在2升磨口回流瓶中,加入100克鎢酸鈉(Na2WO4•2H2O),25克鉬酸鈉(Na2MOO4•2H2O)及700毫升蒸餾水,再加50毫升85%磷酸,100毫升濃鹽酸,充分混合,接上回流管,以小火回流10小時,回流結束時,加入150克硫酸鋰(Li2SO4),50毫升蒸餾水及數滴液體溴,開口繼續沸騰15分鐘,以便驅除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色(如仍呈綠色,須再重復滴加液體溴的步驟)。稀釋至1升,過濾,濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標準NaOH滴定,酚酞作指示劑,然后適當稀釋,約加水1倍,使最終的酸濃度為1n左右。
 
  (3)標準蛋白質溶液: 精確稱取結晶牛血清清蛋白或g―球蛋白,溶于蒸餾水,濃度為250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁,可改用0.9%NaCl溶液。
 
  2.器材
 
  (1)可見光分光光度計
 
  (2)旋渦混合器
 
  (3)秒表
 
  (4)試管16支
 
  (三)操作方法
 
  1.標準曲線的測定:取16支大試管,1支作空白,3支留作未知樣品,其余試管分成兩組,分別加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升標準蛋白質溶液(濃度為250mg/ml)。用水補足到1.0毫升,然后每支試管加入5毫升試劑甲,在旋渦混合器上迅速混合,于室溫(20~25℃)放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙(folin―酚試劑),同樣立即混勻。這一步混合速度要快,否則會使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘,以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照,于700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質的量為橫座標,吸光度值為縱座標,繪制出標準曲線。
 
  注意:因lowry反應的顯色隨時間不斷加深,因此各項操作必須精確控制時間,即第1支試管加入5毫升試劑甲后,開始計時,1分鐘后,第2支試管加入5毫升試劑甲,2分鐘后加第3支試管,余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘,則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙,1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙,2分鐘后加第3支試管,余此類推。待最后一支試管加完試劑后,再放置30分鐘,然后開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。
 
  進行多試管操作時,為了防止出錯,每位學生都必須在實驗記錄本上預先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量(毫升),并按由左至右,由上至下的順序,逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質的量(微克)和測得的吸光度值。
 
  2.樣品的測定:取1毫升樣品溶液(其中約含蛋白質20~250微克),按上述方法進行操作,取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標準曲線的測定放在一起,同時進行。即在標準曲線測定的各試管后面,再增加3個試管。如上表中的8、9、10試管。
 
  根據所測樣品的吸光度值,在標準曲線上查出相應的蛋白質量,從而計算出樣品溶液的蛋白質濃度。
 
  注意:由于各種蛋白質含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸,顯色的深淺往往隨不同的蛋白質而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質的相對濃度(相對于標準蛋白質)。
 
  四、改良的簡易folin―酚試劑法
 
  (一)試劑
 
  1.試劑甲:堿性銅試劑溶液中,含0.5n NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸鉀和0.05%硫酸銅,配制時注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解后,最后加入。
 
  2.試劑乙:與前面的基本法相同。臨用時加蒸餾水稀釋8倍。
 
  3.標準蛋白質溶液:同基本法。
 
  (二)操作步驟
 
  測定標準曲線與樣品溶液的操作方法與基本法相同。只是試劑甲改為1毫升,室溫放置10分鐘后,試劑乙改為4毫升。在55℃恒溫水浴中保溫5分鐘。用流動水冷卻后,在660nm下測定其吸光度值。
 
  改良的快速簡易法,可獲得與folin―酚試劑法(即lowry基本法)相接近的結果。
 
  五、考馬斯亮蘭法(bradford法)
 
  (一)實驗原理
 
  雙縮脲法(biuret法)和folin—酚試劑法(lowry法)的明顯缺點和許多限制,促使科學家們去尋找更好的蛋白質溶液測定的方法。
 
  1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法(bradford法),是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點,因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。
 
  考馬斯亮蘭g-250染料,在酸性溶液中與蛋白質結合,使染料的最大吸收峰的位置(lmax),由465nm變為595nm,溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。經研究認為,染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結合。
 
  在595nm下測定的吸光度值a595,與蛋白質濃度成正比。
 
  (二)試劑與器材
 
  1.試劑:
 
  (1)標準蛋白質溶液,用g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa),配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標準蛋白質溶液。
 
  (2)考馬斯亮蘭g—250染料試劑:稱100mg考馬斯亮蘭g—250,溶于50ml 95%的乙醇后,再加入120ml 85%的磷酸,用水稀釋至1升。
 
  2.器材:
 
  (1)可見光分光光度計
 
  (2)旋渦混合器
 
  (3)試管16支
 
  (三)操作方法
 
  1.標準方法
 
  (1)取16支試管,1支作空白,3支留作未知樣品,其余試管分為兩組按表中順序,分別加入樣品、水和試劑,即用1.0mg/ml的標準蛋白質溶液給各試管分別加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml,然后用無離子水補充到0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭g—250試劑,每加完一管,立即在旋渦混合器上混合(注意不要太劇烈,以免產生大量氣泡而難于消除)。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。
 
  (2)加完試劑2-5分鐘后,即可開始用比色皿,在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值a595,空白對照為第1號試管,即0.1mlH2O加5.0mlg—250試劑。
 
  注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色),可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗,以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。
 
  2.微量法
 
  當樣品中蛋白質濃度較稀時(10-100mg/ml),可將取樣量(包括補加的水)加大到0.5ml或1.0ml,空白對照則分別為0.5ml或1.0ml H2O,考馬斯亮藍g-250試劑仍加5.0ml,同時作相應的標準曲線,測定595nm的光吸收值。
 
  0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.29。
 
  六、紫外吸收法
 
  蛋白質分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵,使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm處,其吸光度(即光密度值)與蛋白質含量成正比。此外,蛋白質溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下,蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系,可以進行蛋白質含量的測定。
 
  紫外吸收法簡便、靈敏、快速,不消耗樣品,測定后仍能回收使用。低濃度的鹽,例如生化制備中常用的(NH4)2SO4等和大多數緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續檢測,因為此時只需測定蛋白質濃度的變化,而不需知道其絕對值。
 
  此法的特點是測定蛋白質含量的準確度較差,干擾物質多,在用標準曲線法測定蛋白質含量時,對那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質,有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質,會出現較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表,再進行計算的方法,加以適當的校正。但是因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不相同的,雖然經過校正,測定的結果還是存在一定的誤差。
 
  此外,進行紫外吸收法測定時,由于蛋白質吸收高峰常因ph的改變而有變化,因此要注意溶液的ph值,測定樣品時的ph要與測定標準曲線的ph相一致。
 
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