做 WB 之前，蛋白質(zhì)的提取至關(guān)重要，成也提取敗也提取。現(xiàn)在開講;

一、單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：

1.倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。

2.每瓶細(xì)胞加 3 ml 4℃ 預(yù)冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動(dòng) 1 min 洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將 PBS 棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。

3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF 要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）

4.每瓶細(xì)胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。

5.裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）

6.于 4℃ 下 12000rpm 離心 5 min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）

7.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒 0.5 min 的離心管中放于-20℃ 保存。

（個(gè)人感覺上述方法可操作性有待加強(qiáng)，細(xì)胞中蛋白本來就很少，一瓶 50 ml 的細(xì)胞有時(shí)按照實(shí)驗(yàn)要求只能加 100-200μ 的裂解液，按照上述操作，直接用 200μ 裂解液進(jìn)行裂解，根本就不夠瓶壁上沾的。本人是先用預(yù)冷的 PBS（一般數(shù)毫升）加入后，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至試管中，如果數(shù)瓶細(xì)胞是收集同一蛋白的，可以放在同一試管，離心后再將蛋白轉(zhuǎn)移到 EP 管中，這樣可操作性就比較強(qiáng)）

二、組織中總蛋白的提取：

1.將少量組織塊置于 1～2 ml 勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。

2.加 400 μ 單去污劑裂解液裂（含 PMSF）于勻漿器中進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。

3.幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。

4.裂解 30 min 后，即可用移液器將裂解液移至 1.5 ml 離心管中，然后在 4℃ 下 12000rpm 離心 5 min，取上清分裝于 0.5 ml 離心管中并置于-20℃ 保存。

三、加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：

由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來，所以除按（一）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提取：

1.將培養(yǎng)液倒至 15 ml 離心管中，于 2500rpm 離心 5 min。

2.棄上清，加入 4 ml PBS 并用槍輕輕吹打洗滌，然后 2500rpm 離心 5 min。棄上清后用 PBS 重復(fù)洗滌一次。

3.用槍洗干上清后，加 100 μ 裂解液（含 PMSF）冰上裂解 30 min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。

4.將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起 4℃.12000rpm 離心 5 min，取上清分裝于 0.5 ml 離心管中并置于-20℃ 保存。