酪安酸差色光譜法:
1. 打開分光光度劑,預熱30分鐘,是紫外燈處于穩定發光狀態
2. 在2容積為1mlde 微量石英比色杯中分別加入900ulPH7.4,PH12.0的0.1mol/l磷酸緩沖液,把盛有PH12.0緩沖液的比色杯放入樣品杯中放入支架上,把盛有PH7.4緩沖液的比色杯放入到參比杯的支架上,然后準確的測出295nm波長下的光吸收值,或用250-350nm掃描
3. 在上述的2個比色杯中分別加入100UL的待測樣品液,小心振蕩混勻
4. 重復2操作
5. 計算蛋白濃度:﹝(PH為12.0A295-PH為7.4A295)/2.330×N﹞×W
N是蛋白分子中酪安酸毫摩爾消光系數之差
W是樣品稀釋倍數
紫外光吸收法測定蛋白濃度:
1.用品和儀器:紫外分光光度劑,微量自動取液儀
2.試劑:標準蛋白質溶液:準確稱重的純凈蛋白質,配成1mg/ml儲液置于4度中備用
0.1mol/l磷酸緩沖液,PH7.4;0.1mol/l磷酸緩沖液,PH12.0
3.試驗程序:
1,在2個潔凈干凈的石英比色杯中(內徑1cm)中加入蒸餾水或其他用于溶解標準蛋白質與待測樣品的緩沖液,其中一個作為參比杯(在以后測量不變),另一個作為樣品杯,放入分光光度劑的相應位置
2,記錄下空白杯在280260nm處的光吸收值,或對之進行250-350nm波長范圍的基線掃描
3,移去樣品比色杯中的蒸餾水或是緩沖液,干燥比色杯(用濾紙吸取殘液)
4,在樣品比色杯中加入待測樣品液,在實驗中提取樣品30ul加入2970ul雙證水,混勻,樣品液事先通過離心或用0.2um孔徑的濾膜過濾
5,重復2步驟
6.蛋白含量計算:蛋白濃度(mg/ml)=1。55A280—0.76A260
Folin法測定蛋白含量:
1.用品和儀器:分光光度劑,試管及試管架,微量自動取液儀(20,100,200,1000UL)
2.試劑:試劑甲:貯液A(4g/100mlNa2CO3),貯液B(0.2mol/100lNaOH),貯液C(1g/100mlCuSO4.5H2O),貯液D(2g/100ml 酒石酸鉀鈉)臨用前將A和B等體積混合為碳酸鈉-氫氧-化鈉溶液,C與D混合盛Folin-酚試劑甲,一天內有效
試劑乙:取烏酸鈉100G,目酸鈉25G,置于2000ml膜口回流裝置內,加蒸餾水700ml,85%磷酸50ml和濃鹽酸100ml,充分混勻,使其溶解。小火加熱,回流10小時(燒瓶中加入玻璃珠以防溶液外濺)再加入硫酸鋰150g蒸餾水50ml及液-溴數滴,在通風廚開口煮沸15分鐘,以除去多余的溴,冷卻后定容與1000ml,過濾即成Folin-酚試劑乙貯存液,顏色為鮮黃色,置于棕色瓶中,可在冰箱長期保存,顏色變綠,在加幾滴溴,煮沸數分鐘,恢復原色試劑乙在使用前應該確定其酸度,使之滴定標準氫氧-化鈉試劑(1mol/l),以酚酞為指示劑,當溶液顏色由紅-紫紅-紫灰-墨綠即可為終點,酸度為2MOL/L將其稀釋到1mo/l即可
標準蛋白質溶液:精-確稱取結晶牛血清蛋白3mg溶于雙證水中,定容于10ML,濃度為0.3mg/ml
3.實驗方法:1.取16mm*150mm試管13支,標明號碼,放置與試管架,在1-11號試管中分別加入標準牛蛋白血清(0.3mg/ml)0,0.1,0.2--------1.0ml,補足雙蒸水至每管體積1.0ml,在12,13管中加入待測樣品100UL,并補足雙蒸水至1.0ml
3. 加入5.0ml新配置的試劑甲,立即混勻,在室溫下放置10分鐘
4. 各管中加入0.5ml試劑乙,充分混勻,(用振蕩器),然后室溫放置30-60min
5. 將標準樣及待測樣品在可見光光度計上比色,如果蛋白含量低于500UG/ML,在750nm下比色,如果在100ug/ml之內,則在550nm波長下比色
6. 根據已知含量的標準樣品測得的光吸收值做標準曲線,然后根據待測樣品的光吸收值在標準曲線上查出蛋白含量