一、基本原理

芽孢染色法是利用細(xì)菌的芽孢和菌體對染料的親合力不同的原理，用不同染料進(jìn)行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難，因此，當(dāng)先用一弱堿性染料，如孔雀綠（malachite green）或堿性品紅（basicfuchsin）在加熱條件下進(jìn)行染色時(shí)，此染料不僅可以進(jìn)入菌體，而且也可以進(jìn)入芽孢，進(jìn)入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出，若再用復(fù)染液（如番紅液）或襯托溶液（如黑色素溶液）處理，則菌體和芽孢易于區(qū)分。

二、器材

枯草芽孢桿菌，蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），生孢梭菌（Clostridium sporogenes）；

孔雀綠染液，番紅水溶液，苯酚品紅溶液，黑色素溶液等。

三、操作步驟

方法1、

（1）將培養(yǎng)24小時(shí)左右的枯草芽孢桿菌或其他芽孢桿菌，作涂片、干燥、固定。

（2）滴加3—5滴孔雀綠染液于已固定的涂片上。

（3）用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時(shí)可添加少許染液。加熱時(shí)間從染液冒蒸汽時(shí)開始計(jì)算約4—5分鐘。這一步也可不加熱，改用飽和的孔雀綠水溶液（約7．6％）染10分鐘。

（4）傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。

（5）用番紅水溶液復(fù)染1分鐘，水洗。

（6）待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。

方法2、

（1）取二支潔凈的小試管，分別加入0．2ml無菌水，再往一管中加入1—2接種環(huán)的蠟狀芽孢桿菌的菌苔，另一管中加入1—2接種環(huán)的生孢梭菌的菌苔，兩管各自充分混合成濃厚的菌懸液。

（2）在菌懸液中分別加入0．2ml苯酚品紅溶液，充分混合后，于沸水浴中加熱3—5分鐘。

（3）用接種環(huán)分別取上述混合液2—3環(huán)于兩片載玻片上，涂薄，風(fēng)干后，將載玻片稍傾斜于燒杯上，用95％乙醇沖洗至無紅色液流出。

（4）再用自來水沖洗，濾紙吸干。

（5）取1—2接種環(huán)黑色素溶液于涂片處，立即展開涂薄，自然干燥后，油鏡觀察，在淡紫灰色背景的襯托下，菌體為白色，菌體內(nèi)的芽孢為紅色。

四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告