基因載體是基因工程的核心，也是基因治療中強(qiáng)有力的生物工具，我們先來認(rèn)識(shí)和閱讀載體圖譜吧。

一、載體分類及載體組成元件

載體分類

1、按屬性分類：病毒載體和非病毒載體

病毒載體是一種常見的分子生物學(xué)工具，可將遺傳物質(zhì)帶入細(xì)胞，原理是利用病毒具有傳送其基因組進(jìn)入目的細(xì)胞，進(jìn)行感染的分子機(jī)制。可發(fā)生于完整活體或是細(xì)胞培養(yǎng)中。可應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、基因療法或疫苗。用于基因治療和疫苗的病毒載體應(yīng)具備以下基本條件：

（1）攜帶外源基因并能包裝成病毒顆粒；

（2）介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達(dá)；

（3）對(duì)人體不致病；

（4）在環(huán)境中不會(huì)引起增殖和傳播。

   非病毒載體一般是指質(zhì)粒DNA。

2、按進(jìn)入受體細(xì)胞的類型分類：原核載體、真核載體、穿梭載體（含原核和真核2個(gè)復(fù)制子，能在原核和真核細(xì)胞中復(fù)制，并可以在真核細(xì)胞中有效表達(dá)）。

3、按功能分類：克隆載體、表達(dá)載體

克隆載體：具有克隆載體的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以攜帶DNA-片段或外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞并克隆和大量擴(kuò)增DNA-片段（外源基因）的載體。

   表達(dá)載體：克隆載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控（具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序）有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。

載體組成元件

1、復(fù)制起始位點(diǎn)Ori：即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。Ori的箭頭指復(fù)制方向，其他元件標(biāo)注的箭頭多指轉(zhuǎn)錄方向（正向）。

2、抗生素抗性基因：可以便于加以檢測(cè)，如Amp+ ，Kan+

（1）Ampr：水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。

（2）tetr ：可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。

（3）camr：生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。

（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。

（5）hygr：使潮霉素β失活。

3、多克隆位點(diǎn)：MCS克隆攜帶外源基因片段，它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)，便于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。還要再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10kb的外源DNA-片段。一般來說，外源DNA-片段越長(zhǎng)，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。

4、P/E：?jiǎn)?dòng)子/增強(qiáng)子

5、Terms：終止信號(hào)

6、加poly（A）信號(hào)：可以起到穩(wěn)定mRNA作用

示例閱讀載體：

pENTER載體

1）human ORF + pENTER載體 

2） CMV啟動(dòng)子，T7啟動(dòng)子 

3） ORF的C端融合了Flag和His tag

4)  多克隆位點(diǎn)，常用AsisI 和 MluI(人源基因上不常見的) 

4） SV40 poly（A）加尾信號(hào)

5） SV40啟動(dòng)子啟動(dòng)的puro標(biāo)記 

6） 2個(gè)腺病毒ITR序列和2個(gè)與腺病毒Ad5同源的序列，可用于將ORF序列同源重組到腺病毒載體，直接用于腺病毒的生產(chǎn)。

慢病毒載體

1）EF1a啟動(dòng)目的基因（可添加小標(biāo)簽FLAG或HIS等小標(biāo)簽） 

2）CMV啟動(dòng)GFP，非融合抗性篩選標(biāo)記Puro（便于做細(xì)胞株的穩(wěn)篩）

3）WPRE（來自土撥鼠肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件），放置在目的基因的上游，能加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)

4)  cPPT（來自HIV-1整合酶基因），增加慢病毒在宿主基因組的拷貝數(shù)，提高病毒滴度

5）第三代慢病毒載體，載體中還包含HIV-1基因組中的順式調(diào)節(jié)元件(ψ 包裝 信號(hào)和LTR 長(zhǎng)末端重復(fù)序列，其中3’LTR增強(qiáng)子功能缺失，5’LTR中U3區(qū)替代為CMV，更加安全的病毒載體)

腺相關(guān)病毒載體

AAV表達(dá)載體包括了中兩個(gè)ITR + CMV（可替換其他組織特異性啟動(dòng)子，見改造載體部分）+ globin intron 內(nèi)含子序列 + 目的基因 + poly A序列

二、選擇和準(zhǔn)備載體

選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)還要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)等。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個(gè)特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。選用哪種載體，還是要結(jié)合目的基因及載體特點(diǎn)以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。

載體選擇主要考慮下述3點(diǎn)：

1、構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴(kuò)增/表達(dá)表達(dá)，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體。

2、載體的類型：

（1）克隆載體的克隆能力—據(jù)克隆片段大小（大選大，小選小）。尤其對(duì)于病毒載體來說，載體包裝容量的大小是評(píng)估能否成功包裝病毒的首要因素。

①腺病毒可以插入長(zhǎng)約8kb的外源基因。目前，我們包裝過長(zhǎng)度為7.5kb外源基因的腺病毒。

②慢病毒的包裝容量約為6kb（包含載體帶有的其他抗性基因或報(bào)告基因），但是2kb以上的外源基因包裝慢病毒難度就增加了，增大1kb會(huì)下降1個(gè)單位數(shù)量級(jí)的滴度，故2kb以上的基因包裝慢病毒需要進(jìn)行評(píng)估。此外，毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白（作為受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白行使功能）等由于其本身的功能，包裝可能會(huì)有一定難度。

③AAV的總包裝容量是4.7 kb（包含載體中兩個(gè)ITR約0.3kb +具體啟動(dòng)子 + 內(nèi)含子約0.6kb + 具體熒光標(biāo)簽 + polyA約0.2kb），所以插入目的基因一般約2kb 左右。由于AAV包裝容量有限，目的基因大于2kb，可考慮去除內(nèi)含子，因?yàn)閮?nèi)含子只是有助于插入的目的基因穩(wěn)定表達(dá)。

（2）確定表達(dá)蛋白的目的，然后再來選擇優(yōu)勢(shì)的表達(dá)質(zhì)粒。一般分為原核表達(dá)和真核表達(dá)質(zhì)粒，前者主要用于體外純化蛋白，如帶His-tag的PET系列，帶GST-Tag的PGEX系列，選用不同的表達(dá)載體，就得建立相應(yīng)的純化系統(tǒng)，包括緩沖液的配置、珠子/柱子的選擇等等，還得考慮目的蛋白的可溶性，一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些，如GST的。這種原核純化的蛋白一般用來制備單一的、需要量大的蛋白。真核表達(dá)載體一般是細(xì)胞、體內(nèi)表達(dá)等需要時(shí)所用，只需要將它放到細(xì)胞或體內(nèi)細(xì)胞即可，唯1考慮的是它的啟動(dòng)子的選擇，常用都是cmv啟動(dòng)子的，表達(dá)效率較高，也有多種啟動(dòng)子經(jīng)過改造的表達(dá)載體，一般用來表達(dá)需要調(diào)控表達(dá)時(shí)間及表達(dá)量的蛋白。

3、載體MCS中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于連接，不產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位。

①選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1-1.5kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）；

②一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般10個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個(gè)；

③必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地；

④必需有易檢測(cè)的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因。

選擇載體還需注意：

無標(biāo)簽載體，起始/終止密碼子都要添加！

標(biāo)簽在N端的載體，終止密碼子要添加！

標(biāo)簽在C端的載體，起始密碼子要添加！

（詳細(xì)解讀如下）

①對(duì)于無起始密碼子和終止密碼子的基因，插入無標(biāo)簽的載體要加入起始密碼子和終止密碼子。

②載體N端有標(biāo)簽，上游引物要對(duì)讀碼框；下游引物要加終止密碼子(為了保證基因的表達(dá),少翻譯載體序列) 。

鏈接：對(duì)讀碼框是為了防止移碼，是不是移碼要看載體圖譜，看酶切位點(diǎn)。從ATG開始，要保證三個(gè)堿基編碼的氨基酸不能影響插入目的基因的正常編碼，若影響了插入目的基因的正常編碼就要在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候在酶切位點(diǎn)前或者后插入一個(gè)或者兩個(gè)堿基，總之是不能影響插入目的基因的正常編碼蛋白。有的酶切位點(diǎn)含有起始密碼子，如果標(biāo)簽在C端像Nco I就有一個(gè)ATG，這時(shí)候需要加堿基在酶切位點(diǎn)后面。

③載體C端有標(biāo)簽，上游引物要加起始密碼子，且考慮是否加Kozak序列（真核表達(dá)系統(tǒng)）；下游引物要對(duì)讀碼框，并且要去掉基因本身的終止密碼子（保證C端標(biāo)簽表達(dá)）。

鏈接：Kozak序列是位于真核生物mRNA 5’端帽子結(jié)構(gòu)后面的一段核酸序列，通常是GCCGCCRCC（常見的序列是GCCACC），位于起始密碼子（ATG）之前。它可以與翻譯起始因子結(jié)合而介導(dǎo)含有5’帽子結(jié)構(gòu)的mRNA翻譯起始。在真核生物中，該序列相對(duì)比較保守。對(duì)應(yīng)于原核生物的SD序列（原核基因在mRNA5’端起始密碼子AUG上游一段對(duì)mRNA的翻譯起作用的序列）。

添加Kozak序列的好處：核糖體需要Kozak序列進(jìn)行穩(wěn)定結(jié)合有助于提高真核基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的效率。

三、改造載體

1、改造啟動(dòng)子：一般在過表達(dá)載體中CMV屬于廣譜型的強(qiáng)啟動(dòng)子，具體可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，選用不同啟動(dòng)子，尤其是對(duì)于AAV載體構(gòu)建時(shí)選用組織特異性啟動(dòng)子。

2、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡男枰?/p>

①構(gòu)建過表達(dá)or干擾載體

根據(jù)實(shí)驗(yàn)用途選擇載體，如過表達(dá)載體通常選用CMV啟動(dòng)子，CMV因其集中了細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)而具有異常高的活性，是*的真核表達(dá)中的增強(qiáng)子，一般插入某個(gè)基因的CDS區(qū)到CMV啟動(dòng)子下游，CMV負(fù)責(zé)啟動(dòng)該基因的表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)高該基因表達(dá)的作用；而U6和H1更多的是用于shRNA的啟動(dòng)來達(dá)到敲低一個(gè)基因的作用，U6和H1啟動(dòng)子都是RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動(dòng)子，其特點(diǎn)是啟動(dòng)子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達(dá)約21個(gè)核苷酸和約50個(gè)核苷酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)（stem loop），RNA聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，當(dāng)RNA聚合酶Ⅲ到連續(xù)4個(gè)或5個(gè)T時(shí)，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會(huì)停止。

我們公司的shRNA病毒載體（包括腺病毒載體、慢病毒載體和腺相關(guān)病毒載體）是由U6或H1 啟動(dòng)shRNA 實(shí)現(xiàn)，并連接了報(bào)告基因，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)載體的轉(zhuǎn)染效率。構(gòu)建干擾載體針對(duì)目的基因（目的基因需要大于0.7kb，若小于0.7kb需要評(píng)估來確保能設(shè)計(jì)出8條shRNA序列），設(shè)計(jì)并提供4個(gè)針對(duì)靶基因的shRNA產(chǎn)品，確保4個(gè)shRNA中的1個(gè)產(chǎn)品在細(xì)胞感染效率達(dá)80%以上的前提下，在mRNA水平至少有70%的沉默效果；也可以按照客戶的要求來設(shè)計(jì)，由客戶確定shRNA 序列的長(zhǎng)度，對(duì)于每條選定的靶序列，設(shè)計(jì)正義鏈和反義鏈，以 loop莖環(huán)結(jié)構(gòu)相連，合成shRNA。

②是否攜帶GFP等熒光標(biāo)簽

攜帶熒光標(biāo)簽基本目的是為了觀察感染目的細(xì)胞的效率；攜帶該標(biāo)簽的好處之一是不用破碎組織細(xì)胞和不加任何底物，直接通過熒光顯微鏡就能在活細(xì)胞中發(fā)出綠色熒光，實(shí)時(shí)顯示目的基因的表達(dá)及定位情況，而且熒光性質(zhì)穩(wěn)定。但是，由于GFP標(biāo)簽比較大（約720bp），這種大標(biāo)簽在位置上對(duì)目的基因造成了空間位阻作用，對(duì)蛋白的空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，從而不利于目的基因蛋白本身的活性及正常功能的發(fā)揮。此外，還需要結(jié)合蛋白本身的特性，比如該蛋白為具有切割活性的蛋白，即使融合了GFP，標(biāo)簽很有可能會(huì)被破壞，終究會(huì)影響GFP的熒光及基本功能。一般不建議融合這么大的標(biāo)簽，實(shí)驗(yàn)需要帶熒光標(biāo)簽，建議構(gòu)建載體時(shí)通過P2A非融合。

③是否融合6×His、HA、Myc、FLAG等小標(biāo)簽

為了做免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)或者WB檢測(cè)蛋白表達(dá),需要加融合小標(biāo)簽。多數(shù)情況下,由于多肽標(biāo)簽相對(duì)較小，對(duì)目的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響小。但是在蛋白合成肽鏈的過程中，如果影響了蛋白的折疊，也會(huì)造成目的蛋白活性的下降甚至功能的喪失。

④是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。

鏈接：?jiǎn)?dòng)子：促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄的DNA序列，這個(gè)DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼區(qū)的上游，是DNA分子上可以與RNA聚合酶特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄。

增強(qiáng)子：為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序，其作用與其所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。

沉默子：負(fù)增強(qiáng)子，負(fù)調(diào)控序列。

核糖體結(jié)合位點(diǎn)/SD序列：mRNA的起始AUG上游約8~13核苷酸處，存在一段由4~9個(gè)核苷酸組成的共有序列，可被16SrRNA通過堿基互補(bǔ)精確識(shí)別的序列被稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)/SD序列是對(duì)原核生物而言，在mRNA 5’ 端起始密碼子AUG上游一段對(duì)mRNA的翻譯

起作用的序列。

轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的后一個(gè)外顯子中有一個(gè)AATAAA的保守序列，此位點(diǎn)下游有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly（A）加尾信號(hào)。　

3、載體中P2A和IRES的選擇：

四、影響載體選擇的因素：

? 原核表達(dá) or 真核表達(dá)

? 細(xì)胞實(shí)驗(yàn) （過表達(dá) or 干擾、瞬時(shí)表達(dá) or穩(wěn)轉(zhuǎn)株、基因大小、熒光、藥篩 ）

?動(dòng)物實(shí)驗(yàn) （過表達(dá) or 干擾、注射部位、基因大小、觀察周期 ）