ELISA 實驗過程中常常出現讓人難以琢磨的結果。其中陰性對照出現高背景的情況也時有發生，這樣導致結果不那么可信。出現高背景的原因可能如下。

1. 抗體、抗體的濃度不合適
抗體質量不好，特異性不高可能會與封閉液（BSA）產生交叉反應，可以用 0.8% 的明膠代替，本底就很好了。
抗體親和力不好，也會如此，由于加大了抗體的使用量，必然造成了非特異性增加的可能。

2. 封閉液成分、封閉液的濃度、封閉時間
封閉液，如 BSA 可能與抗體發生交叉反應，導致背景偏高。
封閉液的濃度偏低，封閉時間過短，導致封閉不*，抗體與酶標板孔結合，也可能導致背景偏高。

3. 孵育時間、孵育溫度
孵育時間過長 、溫度過高，也可能會導致非特異性結合增加，從而造成本底增高。

4. 洗板液成分、洗板的時間
一般用 PBS 洗板就可以了，但有時候可以在洗板液中加入一些表面活性劑，如 tween-20。
洗板的時間不足，會導致抗體殘留，引起陰性對照顯色。如果是機洗，可以改為手洗少量嘗試，增加洗板時間。機洗一般沒有手洗去除干凈。

5. 顯色時間
由于系統優化不好，導致樣品顯色較弱，而延長了顯色時間，這樣一來導致陰性對照也有部分顯色。此時，應該優化檢測系統，調整包被物、檢測抗體、底物等的濃度，縮短顯色時間，顯色一般不超過 15 min。

6. 樣品
樣品中含有干擾物質。此時可以優化系統，調整其他檢測抗體的比例，而增加樣品的稀釋度、增加洗脫步驟等。

7. ELISA 板的選擇
聚苯乙烯制備的 ELISA 板經射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時空白值較大。
與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為 ELISA 固相載體的一種，聚氯乙烯的特點為質軟板薄，可剪割，價廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。