質粒小量提取試劑盒II型,Plasmid Mini Kit II(200)詳細介紹
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名稱:質粒小量提取試劑盒II型
英文名/型號:Plasmid Mini Kit II(200)
品牌:Omega
供應商:上海遠慕
用途:從小于15ml培養過夜的菌液提取50-70ug高純度質粒DNA
為了滿足生物領域日益增加的要求,Omega新開發的基于磁珠的純化方式,以其高結合力和高純度的核酸產物等*性,已經在歐美市場得到廣泛的接收。Omega的磁珠純化方式,與目前大部分公司采用的硅磁顆粒不同,它采用的是納米磁珠同正離子相藕連而成的微型顆粒,該顆粒的結合能力是傳統硅磁的10-30倍,因而能大大提高核酸產量和純度,目前該產品處于世界zui的水平。此外,為滿足不同客戶的需求,Omega還開發了一些成本較低的核酸純化試劑盒,如鹽析法純化血液或組織基因組DNA純化試劑盒,玻璃奶純化試劑盒以及溶液型的RNA抽提試劑盒。
質粒小量提取試劑盒II型,Plasmid Mini Kit II(200)操作步驟:
1.樣本處理收集已培養1216小時的菌液13ml12000rpm離心1分鐘盡量吸除上清。 注:菌液較多時可以通過多次重復離心將菌體收集到1個離心管中。菌液收集量由菌濃而定收集菌體過多會反而降低裂解效果。
2.懸浮向菌體沉淀的離心管中加入250ul溶液Ⅰ用移液器反復吹打或渦旋振蕩器*懸浮細菌細胞沉淀。
3.裂解加入250ul溶液Ⅱ于細菌懸液中溫和地上下顛倒6~8次,使菌體充分裂解,加1管混合1管,確保溶液充分、及時的混勻。充分裂解后的菌液會變得相對粘稠為防止DNA斷裂避免劇烈混勻操作及裂解時間過長。
4.中和加入350ul溶液Ⅲ, 立即溫和上下顛倒6~8次充分混勻,加1管混合1管。此時會出現白色絮狀沉淀靜置2分鐘12000rpm離心5分鐘可適當延長至10min。
注:溶液Ⅲ加入后應立即混勻避免產生局部沉淀。若上清液中仍存在微小白色沉淀,可重復離心后取上清。
5.吸附小心地將上清液轉移至吸附柱中12000rpm離心30~60秒,棄收集管中廢液,然后將吸附柱重新套入廢液收集管中。若上清一次加不完,可重復操作轉移時不可吸入沉淀,此步很重要。
6.漂洗向吸附柱中加入600ul漂洗液PW,使用前請檢查是否已加入無水乙醇,12000rpm離心30~60秒。
7.重復步驟6,棄收集管中廢液。
8.將吸附柱套于收集管中10000rpm離心2分鐘。
注:此步驟不可省略,目的是去除吸附柱中殘余的漂洗液,因為漂洗液中乙醇的殘留會影響后續實驗,酶切,PCR等。
9.洗脫將吸附柱置于一干凈的1.5ml離心管中向吸附柱膜中央部位懸空滴加50~100ul溶解液TE或滅菌雙蒸水,pH值在7.0-8.5,室溫靜置2~10分鐘,12000rpm離心2分鐘,即得提取質粒DNA置-20℃保存。
1.使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現混濁,如有混濁現象,可在 37℃水浴中加熱幾分鐘,待溶液恢復澄清后再使用。溶液Ⅱ 、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應立即擰緊蓋子。
2.洗脫緩沖液體積不應少于 50ul,體積過小影響回收效率;洗脫液的 pH 值對洗脫效率也有影晌,若需要用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調至此范圍), pH值低于7. 0會降低洗脫效率, DNA產物應保存在-20℃,以防 DNA 降解。
3.如果所提質粒為低拷貝質粒或大于 10kb 的大質粒,應加大菌體使用量,使用 5-10ml 過夜培養物,同時按照比例增加溶液Ⅰ 、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量,吸附和洗脫時可以適當的延長時間,以增加提取效率。
4.DNA濃度及純度檢測: 得到的質粒DNA純度與樣品保存時間、 操作過程中的剪切力等因素有關。 得到的DNA可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。 DNA應在OD 260 處有顯著吸收峰,OD 260 值為 1 相當于大約 50ug/ml雙鏈DNA、 40ug/ml單鏈DNA。OD 260 /OD 280 比值應為 1.7-1.9,如果洗脫時不使用洗脫緩沖液,而使用去離子水,比值會偏低,因為pH值和離子存在會影響吸光值,但并不表示純度低。