PCR-DNA實驗注意事項
1.加樣方面(混勻,不要有氣泡,管壁上不要有液體)
2.試劑方面(冷凍,不宜反復凍融超過3次;可分裝)
3.使用非肝素鈉抗凝劑采血管
4.實驗室方面(實驗做完注意通風、84清理臺面、紫外線殺菌)
5.注意污染(平常配試劑管蓋的放置不要污染、加樣時指甲及手套不要碰到管內壁)
實驗操作步驟
1.室溫融解;
2.取血清(或標準品)50ul加入50ul核酸提取液先震蕩混勻10秒然后6000轉瞬間離心一下(等離心機轉速到了接近6000按停止)99度水煮或干浴10分鐘,稍微彈碎;然后13000轉離心10分鐘保留上清液備用
3.配混合液
取N*36ul混合液+N*0.4ulTAQ酶混勻(先震蕩混勻10秒然后6000轉瞬間離心)(N為管數,實際上我們要取N+1因為加樣管壁上會沾液不多配會導致zui后一個有誤差例如有10個樣本則取11*36+11*0.4;)
4.取上述混合液36.5ul分別加入pcr反應管不要有氣泡管壁不要有水珠
5.加樣取4ul上清液加入pcr管加樣槍在液體里面反復打個7~8下zui后在離心機稍微離一下6000轉瞬間離心6.上機反應檢查管壁水珠氣泡
實驗結果方面
1.標準曲線相關系數至少為-0.99越小越好
2.根據曲線分析結果(曲線是否穩,無波浪)38循環曲線抬頭為陰性
實線抬頭曲線不抬頭為YMDD變異(實線---病毒量虛線---判斷有無變異)
21個循環值大概為7次方后面加3.5個循環減少一個次方即24.5左右為6次方......
友情提示:上述操作不一定全正確,請自行參考各試劑廠試劑說明書以及檢驗方面相關資料。