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蛋白質組實驗流程的樣品制備原則
點擊次數:1341 更新時間:2016-12-07

    蛋白質組實驗流程的樣品制備原則


    樣品制備是雙向電泳中zui關鍵的一步,將直接影響2-DE結果好壞。目前并沒有一個通用的樣品制備方法,盡管處理方法多種多樣,但都遵循幾個基本的原則:1)盡可能的提高樣品蛋白的溶解度,抽提zui大量的總蛋白,減少蛋白質的損失;2)減少對蛋白質的人為修飾;3)破壞蛋白質與其他生物大分子的相互作用,并使蛋白質處于*變性狀態。


    根據這一原則,樣品制備需要四種主要的試劑:離液劑(chaotropes),主要包括尿素(Urea)和硫脲(thiourea);表面活性劑(sufactants),也稱去垢劑,如CHAPS與Zwittergent系列等雙性離子去垢劑;還原劑(reducingagents),zui常用的是二硫蘇糖醇(DTT)和磷酸三丁酯(TBP)等。當然,也可以選擇性的加入Tris-base,蛋白酶抑制劑以及核酸酶。


    樣品的來源不同,其裂解的緩沖液也各不相同。通過不同試劑的合理組合,以達到對樣品蛋白的zui大抽提。在對樣品蛋白質提取的過程中,必須考慮到去除影響蛋白質可溶性和2DE重復性的物質,比如核酸、脂、多糖等大分子以及鹽類小分子。大分子的存在會阻塞凝膠孔徑,鹽濃度過高會降低等電聚焦的電壓,甚至會損壞IPG膠條,這樣都會造成2-DE的失敗。樣品制備的失敗很難通過后續工作的完善或改進獲得補償。


    核酸的去除可采用超聲或核酸酶處理,超聲處理應控制好條件,并防止產生泡沫;而加入的外源核酸酶則會出現在zui終的2D膠上。脂類和多糖都可以通過超速離心除去。透析可以降低鹽濃度,但時間太長;也可以采取凝膠過濾或沉淀/重懸法脫鹽,但會造成蛋白質的部分損失。


    因此,樣品制備方法必須根據不同的樣品、所處的狀態以及實驗目的和要求來進行選擇。目前有很多方法適于2-DE,如組織或細胞的總蛋白提取物、亞細胞組份或細胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亞組份蛋白(如磷酸化蛋白、采用親合純化凝集素結合蛋白等)。


    一、細胞樣品
    1.細胞培養,加藥與處理。
    2.胰酶消化貼壁細胞,PBS漂洗3次(1500g,5min),棄上清,再次離心,去盡殘液(非常重要?。H缫容^細胞膜蛋白組的差別,用細胞刮收獲細胞。如用10mMTris/250mMSucrose(pH7.0)代替PBS,可有效降低樣品的鹽濃度。
    加入5倍體積裂解液,混勻(或將1×106細胞懸于60~100µl裂解液中)。
    3.加50ug/mlRNase及200ug/mlDnase,在4℃放置15分鐘。
    4.15,000轉,4℃離心60分鐘(或40,000轉,4℃離心30分鐘)。
    5.收集上清。
    6.測定蛋白濃度(采用BioRadRC/DCproteinassaykit)。
    7.分裝樣品,凍存于-70℃。


    二、組織樣品
    1.碾缽碾磨組織,碾至粉末狀。
    2.將適量粉末狀組織轉移至勻漿器,加入適量裂解液,進行勻漿。
    3.加50ug/mlRNase及200ug/mlDNase,在4℃放置15分鐘。
    4.15,000轉,4℃離心60分鐘(或40,000轉,4℃離心30分鐘)。
    5.收集上清,測定蛋白濃度。
    6.分裝樣品,凍存于-70℃。


    注意事項:
    1.8mmol/LPMSF必須在添加還原劑之前用,否則PMSF會失去活性。
    2.40mmol/L濃度以下的Tris可使有些蛋白酶在高pH值下失活。
    3.細胞清洗――大多用PBS,若PBS殘留于細胞表面會造成膠上出現水平條紋,則可利用(10mmol/LTris,250mmol/LsucrosepH7.0)來解決此問題。

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