蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot )
蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot )實(shí)驗(yàn)方法原理:
Western免疫印跡(Western Blot)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法。對(duì)已知表達(dá)蛋白,可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè),對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物,可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè)。
與Southern或Northern雜交方法類似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測(cè)物是蛋白質(zhì),“探針”是抗體,“顯色”用標(biāo)記的二抗。
經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。
蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot )實(shí)驗(yàn)步驟:
一、試劑準(zhǔn)備
1. SDS-PAGE試劑:見(jiàn)聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。
2. 勻漿緩沖液:1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml;10%SDS 6.0 ml;β-巰基乙醇 0.2 ml;ddH2O 2.8 ml。
3. 轉(zhuǎn)膜緩沖液:甘氨酸 2.9 g;Tris 5.8 g;SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4):NaCl 8.0 g;KCl 0.2 g;Na2HPO4 1.44 g;KH2PO4 0.24 g;加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液:考馬斯亮蘭 0.2 g;甲醇80 ml;乙酸2 ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脫脂奶粉,現(xiàn)配):脫脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。
6. 顯色液:DAB 6.0 mg;0.01 M PBS 10.0 ml;硫酸鎳胺 0.1 ml;H202 1.0 μl。
二、蛋白樣品制備
1. 單貼壁細(xì)胞總蛋白的提取
(1) 倒掉培養(yǎng)液,并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液(或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走)。
(2) 每瓶細(xì)胞加3 ml 4℃預(yù)冷的PBS(0.01M pH7.2~7.3)。平放輕輕搖動(dòng)1 min洗滌細(xì)胞,然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次,共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
(3)按1ml裂解液加10 μl PMSF(100 mM),搖勻置于冰上。(PMSF要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。)
(4) 每瓶細(xì)胞加400 μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30 min,為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)。
(5)裂解完后,用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)(動(dòng)作要快),然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中。(整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。)
(6)于4℃下12000 rpm離心5 min。(提前開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷)
(7) 將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 ml的離心管中放于-20℃保存。
2. 組織中總蛋白的提取
(1)將少量組織塊置于1~2 ml勻漿器中球狀部位,用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。
(2) 加400 μL單去污劑裂解液裂(含PMSF)于勻漿器中,進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。
(3)幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上,要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。
(4) 裂解30 min后,即可用移液器將裂解液移至1.5 ml離心管中,然后在4℃下12000 rpm離心5 min,取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于-20℃保存。
3. 加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取
由于受藥物的影響,一些細(xì)胞脫落下來(lái),所以除按1操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?br />(1)將培養(yǎng)液倒至15 ml離心管中,于2500 rpm離心5 min。
(2)棄上清,加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌,然后2500 rpm離心5 min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。
(3)用槍洗干上清后,加100 μL裂解液(含PMSF)冰上裂解30 min,裂解過(guò)程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。
(4)將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm離心5 min,取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于-20℃保存。
三、 蛋白含量的測(cè)定
1. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
(1)從-20℃取出1 mg/ml BSA,室溫融化后,備用。
(2)取18個(gè)1.5 ml離心管,3個(gè)一組,分別標(biāo)記為0 mg,2.5 mg,5.0 mg,10.0 mg,20.0 mg,40.0 mg。
(3)按下表在各管中加入各種試劑。
(4) 混勻后,室溫放置2 min。在生物分光光度計(jì)(Bio-Photometer,Eppendorf)上比色分析。
2. 檢測(cè)樣品蛋白含量
(1)取足量的1.5 ml離心管,每管加入4℃儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液1 ml。室溫放置30 min后即可用于測(cè)蛋白。
(2) 取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml,混勻放置2分鐘可做為空白樣品,將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測(cè)空白樣品。
(3)棄空白樣品,用無(wú)水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5 mL),再用無(wú)菌水洗一次。
(4)取一管考馬斯亮藍(lán)加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待測(cè)蛋白樣品,混勻后靜置2 min,倒入扣干的比色杯中按sample鍵測(cè)樣品。
注意:每測(cè)一個(gè)樣品都要將比色杯用無(wú)水乙醇洗2次,無(wú)菌水洗一次。可同時(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測(cè),這樣對(duì)測(cè)定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時(shí)間。測(cè)得的結(jié)果是5 ml樣品含的蛋白量。
四、SDS-PAGE電泳
1. 清洗玻璃板
一只手扣緊玻璃板,另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖,再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。
2. 灌膠與上樣
(1)玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。(操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊,以免漏膠。)
(2)按前面方法配10%分離膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí),可用10 ml槍吸取5 ml膠沿玻璃放出,待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水,液封后的膠凝的更快。(灌膠時(shí)開(kāi)始可快一些,膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下,這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢,否則膠會(huì)被沖變型。)
(3)當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí),說(shuō)明膠已凝了。再等3 min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。
(4)按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小,從而使加樣孔的上樣體積減小,所以在濃縮膠凝固的過(guò)程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后,兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
(5)用水沖洗一下濃縮膠,將其放入電泳槽中。(小玻璃板面向內(nèi),大玻璃板面向外。若只跑一塊膠,那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。)
(6)測(cè)完蛋白含量后,計(jì)算含50 ng蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5 ml離心管中,加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。(上樣總體積一般不超過(guò)15 μl,加樣孔的zui大限度可加20 μl樣品。)上樣前要將樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性。
(7) 加足夠的電泳液后開(kāi)始準(zhǔn)備上樣。(電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板。)用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品,將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。(加樣太快可使樣品沖出加樣孔,若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí),進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次,以免交叉污染。
3. 電泳
電泳時(shí)間一般4~5 h,電壓為40 V較好,也可用60 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳,進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
五、轉(zhuǎn)膜
1. 轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0~8.3 cm的濾紙和1張7.3~8.6 cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套,因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用。(用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里,要使膜浮于水上,只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸濕。若膜沉入水里,膜與水之間形成一層空氣膜,這樣會(huì)阻止膜吸水。
2. 在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤(pán)里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過(guò)的膜。
3. 將夾子打開(kāi)使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊,用玻棒來(lái)回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。(一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。)在墊子上墊三層濾紙(可三張紙先疊在一起在墊于墊子上),一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。
4. 要先將玻璃板撬掉才可剝膠,撬的時(shí)候動(dòng)作要輕,要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開(kāi)始松動(dòng),直到撬去玻板。(撬時(shí)一定要小心,玻板很易裂。)除去小玻璃板后,將濃縮膠輕輕刮去(濃縮膠影響操作),要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上,用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊,輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上,要蓋滿整個(gè)膠(膜蓋下后不可再移動(dòng))并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。zui后蓋上另一個(gè)海綿墊,搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行,要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸,接觸后會(huì)發(fā)生短路。(轉(zhuǎn)移液含甲醇,操作時(shí)要戴手套,實(shí)驗(yàn)室要開(kāi)門(mén)以使空氣流通。)
5. 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中,要使夾的黑面對(duì)槽的黑面,夾的白面對(duì)槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱,在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫。一般用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h。
6. 轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min(于脫色搖床上搖)。然后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。
六、免疫反應(yīng)
1 . 將膜用TBS從下向上浸濕后,移至含有封閉液的平皿中,室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h。
2. 將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度(在1.5 ml離心管中);撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上,四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整;將抗體溶液加到保鮮膜上;從封閉液中取出膜,用濾紙吸去殘留液后,將膜蛋白面朝下放于抗體液面上,掀動(dòng)膜四角以趕出殘留氣泡;室溫下孵育1~2 h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次10 min;再用TBS洗一次,10 min。
3. 同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸,室溫下孵育1~2 h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次10 min;再用TBS洗一次,10 min,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
七、化學(xué)發(fā)光,顯影,定影
1. 將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合;1 min后,將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸;1 min后,將膜移至另一保鮮膜上,去盡殘液,包好,放入X-光片夾中。
2. 在暗室中,將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤(pán)中;在紅燈下取出X-光片,用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L(zhǎng)和寬均需大1 cm);打開(kāi)X-光片夾,把X-光片放在膜上,一旦放上,便不能移動(dòng),關(guān)上X-光片夾,開(kāi)始計(jì)時(shí);根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間,一般為1 min或5 min,也可選擇不同時(shí)間多次壓片,以達(dá)zuijia效果;曝光完成后,打開(kāi)X-光片夾,取出X-光片,迅速浸入顯影液中顯影,待出現(xiàn)明顯條帶后,即刻終止顯影。顯影時(shí)間一般為1~2 min(20~25℃),溫度過(guò)低時(shí)(低于16℃)需適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間;顯影結(jié)束后,馬上把X-光片浸入定影液中,定影時(shí)間一般為5~10 min,以膠片透明為止;用自來(lái)水沖去殘留的定影液后,室溫下晾干。
應(yīng)注意的是:顯影和定影需移動(dòng)膠片時(shí),盡量拿膠片一角,手指甲不要?jiǎng)潅z片,否則會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。
八、凝膠圖象分析
將膠片進(jìn)行掃描或拍照,用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。
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