遠(yuǎn)慕生物:組織/細(xì)胞RNA快速提取 操作步驟:(實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng))
提示:
次使用前請(qǐng)先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入量無(wú)水乙醇!
操作前在裂解液RLT中加入β-巰基乙醇至終濃度1%,如1 ml RLT 中加入10μl β-巰基乙醇。此裂解液現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的RLT 4℃可放置一個(gè)月。
1. 組織培養(yǎng)細(xì)胞
a. 收集<107懸浮細(xì)胞到一個(gè)1.5ml離心管,對(duì)于貼壁細(xì)胞,孔板培養(yǎng)可以直接裂解,細(xì)胞瓶培養(yǎng)應(yīng)該先用胰蛋白酶消化后吹打下來(lái)收集。
b. 13,000rpm離心10秒(或者300g離心5分鐘),使細(xì)胞沉淀下來(lái)。*吸棄上清,留下細(xì)胞團(tuán),注意不*棄上清會(huì)稀釋裂解液導(dǎo)致產(chǎn)量純度降低。
c. 輕彈管壁將細(xì)胞沉淀*松散重懸,加入350μl(<5x106細(xì)胞)或者600μl(5x106-1x107細(xì)胞)裂解液RLT,吹打混勻后用手劇烈振蕩20秒,充分裂解。
d. 用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配0.9mm針頭) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到滿(mǎn)意勻漿結(jié)果(或者電動(dòng)勻漿30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產(chǎn)量。
e. 接操作步驟項(xiàng)下3。
2. 動(dòng)物組織(例如鼠肝腦)
a. 電動(dòng)勻漿:新鮮組織用解剖刀迅速切成小碎塊,加入350μl(<20mg組織)或者600μl(20-30mg組織)的裂解液RLT后電動(dòng)*勻漿20-40秒。
b. 液氮研磨+勻漿:在液氮中研磨組織成細(xì)粉后,取適量組織細(xì)粉(20mg/30mg)轉(zhuǎn)入裝有350μl/600μl組織裂解液RLT的1.5ml離心管中, 用手劇烈振蕩20秒,充分裂解。用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配0.9mm針頭) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到滿(mǎn)意勻漿結(jié)果(或者電動(dòng)勻漿30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產(chǎn)量。
c. 將勻漿后裂解物13,000rpm離心3分鐘,沉淀可能存在的裂解困難的碎片或者不溶物, 將裂解物上清小心轉(zhuǎn)到一個(gè)新離心管。
d. 接操作步驟項(xiàng)下3。
3. 較估計(jì)裂解物(上清)體積,加入等體積的70%乙醇(請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!),此時(shí)可能出現(xiàn)沉淀,但是不影響提取過(guò)程,立即吹打混勻,不要離心。
4. 立刻將混合物(每次小于700μl,多可以分兩次加入)加入一個(gè)吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)13,000 rpm離心60秒,棄掉廢液。
5. 加700μl 去蛋白液RW1,室溫放置30秒,12,000rpm 離心30秒,棄掉廢液。
如果DNA殘留明顯,可在加入RW1后室溫放置5分鐘再離心。
6. 加入500μl漂洗液RW(請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!),12,000 rpm 離心30秒,棄掉廢液。加入500μl漂洗液RW,重復(fù)一遍。
7. 將吸附柱RA放回空收集管中,13,000 rpm離心2分鐘,盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
8. 取出吸附柱RA,放入一個(gè)RNase free離心管中,根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free water(事先在 70-90℃水浴中加熱可提高產(chǎn)量), 室溫放置1分鐘,12,000 rpm 離心1分鐘。
9. 如果預(yù)期RNA產(chǎn)量>30μg,加30-50μl RNase free water重復(fù)步驟8, 合并兩次洗脫液,或者使用次的洗脫液加回到吸附柱重復(fù)步驟一遍(如果需要RNA濃度高)。
洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高,分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產(chǎn)量比前者高15–30%,但是濃度要低,用戶(hù)根據(jù)需要選擇。
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